Rozdil_5_Praktychni_navychky

06 марта 2017



1. Методика готування мазка з культури, вирощеної на щільному та рідкому поживному середовищі

 

Порядок роботи та методика приготування мазка з культури, що вирощена на рідкому живильному середовищі:

 

1. Для приготування мазка необхідно взяти чисте знежирене предметне скло.

2. Позначити місце нанесення матеріалу склографом з зворотнього боку предметного скла.

3. Предметне скло провести через полум’я спиртівки (стерилізація). Робоча поверхня звернена до полум’я.

4. Петлю прожарити в полум’ї спиртівки, тримаючи її як олівець вертикально у правій руці. Два-три рази провести через полум‘я і нижню третину петлетримача.

5. Не випускаючи петлі, лівою рукою візяти пробірку з культурою кишкової палички, що вирощена на МПБ. Пробку пробірки притиснути до долоні 4-м та 5-м пальцями, пробірку повільно крутіти колоподібними рухами і витягнути з неї пробку.

6. Вінця пробірки, не випускаючи пробки, провести через полум’я, петлю ввести в пробірку та охолодити об стінки пробірки.

7. Бактеріальною петлею набати краплю культури з рідкого середовиша із дотриманням правил стерильності і обережності, не торкаючись стінок пробірки, вийняти її.

8. Далі провести пробку і відкритий край пробірки через полум‘я, після чого її закрийти і поставити у штатив.

9. Взяту культуру нанести на скло і, поступово розтираючи її, приготувати тонкий, рівномірний мазок округлої чи овальної форми діаметром 1 – 1,5 см.

10. Петлю прожарити у полум‘ї спиртівки і поставити у штатив.

11. Висушити мазок на повітрі при кімнатній температурі.

12. Зафіксувати препарат фізичним способом – провести його 3 рази через верхню поверхню полум’я спиртівки (мазок має бути зверху).

13. Пофарбувати препарат — нанести фуксин Пфайфера та потримати його 1 – 2 хвилини, після чого барвник змити водою.

14. Промаркерувати препарат: зліва на предметному склі вказати назву бактерій або матеріалу, що фарбується.

15. Висушений у зошиті для висушування препаратів препарат покласти на предметний столик мікроскопу, нанести на нього краплю імерсійної олії.

16. Мікроскопувати пофарбований препарат, дотримуючись всіх правил мікроскопії з використанням імерсійного об‘єктива (див. робота 3).

17. Результати мікроскопії внести с таблицю.

 

Порядок роботи та методика приготування мазка з культури, що вирощена на щільному живильному середовищі:

1. Для приготування мазка необхідно взяти чисте знежирене предметне скло.

2. Позначити місце нанесення матеріалу склографом з зворотнього боку предметного скла.Предметне скло провести через полум’я спиртівки (стерилізація). Робоча поверхня звернена до полум’я.

3. Петлю прожарити в полум’ї спиртівки, тримаючи її як олівець вертикально у правій руці. Два-три рази провести через полум‘я і нижню третину петлетримача.

4. Не випускаючи петлі, лівою рукою візяти пробірку із стерильним фізіологічним розчином, а 4-м і 5-м пальцями правої руки затиснути ватно-марлеву пробку, витягнути її і вінця пробірки пронести через полум‘я спиртівки, не випускаючи пробки.

5. Петлю ввести у пробірку і охолодити її, торкаючись стінки.

6. Занурюючи петлю в рідину, наберати краплю фізіологічного розчину. Витягнути петлю, провести пробку та відкритий край пробірки через полум‘я, після чого її закрити і поставити у штатив.

7. На центр скельця бактеріологічною петлею нанести краплю фізіологічного розчину.

8. Петлю знов простерилізувати, у ліву руку взяти пробірку з культурою стафілокока, що вирощена на скошеному МПА. Відкрити пробку із дотриманням усіх правил, охолодити петлю і набрати нею невелику кількість культури ковзними рухами.

9. Петлю витягнути, а пробірку закрити і поставити у штатив.

10. Взяту культуру стафілокока нанести на скло біля краплі фізрозчину, поступово розтираючи її та емульгуючи в краплі. Отриману завісь рівномірно розподілити на поверхні скла, діаметр мазка повинен бути в межах 1 – 1,5 см.

11. Мазок висушити на повітрі і зафіксувати, для цього скло провести над полум’ям спиртівки тричі, так щоб мазок був зверху.

12. Препарат пофарбувати генціанвіолетом (1-2 хвилини).

13. Після закінчення фарбування, змити барвник водою та висушити препарат.

14. Препарат мікроскопувати з використанням імерсійного об‘єктива, дотримуючись усіх правил даної мікроскопії (див. роботу 3).

15. Результати мікроскопії внести с таблицю.

 

2.Методика і механізм фарбування за Грамом

1. Взяти чисте знежирене предметне скло.

2. Позначити місце нанесення матеріалу склографом з зворотнього боку предметного скла.

3. Предметне скло провести через полум’я спиртівки (стерилізація). Робоча поверхня звернена до полум’я.

4. Приготувати фіксований препарат із суміші бактерій дотримуючись усіх правил (див. практичну роботу 4 затяття 1).

5. Пофарбувати препарат за методом Грама.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.Метод фарбування спор

На незафарбованому препараті ен-доспори живих бактерій мають чорні краї та яскраво світяться у площині, дещо вище положення справжнього фокуса.

При використанні негативного контрастування 7 % розчин вод­ного нігрозину змішують на покривному скельці з петлею культури, роблять тонкий мазок, який висушують на повітрі. Покривне скельце перевертають мазком донизу, кладуть на предметне скло, фіксуючи його воском або вазеліном. Ендоспори видно як сферичні або еліпсо-видної форми об’єкти, які сильно заломлюють світло.

За методом Ожешко на нефіксований препарат наливають 0,5 % розчин хлористоводневої кислоти і підігрівають 1-2 хв на полум’ї. Піля цього з препарата зливають рештки кислоти, промивають водою, після висихання фіксують у полум’ї та забарвлюють за методом Ціля-Нільсена. Спори набувають червоного кольору, а тіла мікробних клітин — голубого (рис. 16, вкл.).

4.Метод виявлення капсул

 Виявлення капсул у мікрооганізмів має важливе діагностичне значення. Можна спостерігати капсули у Живих бактерій. Для цього краплю суспензії мікробів наносять на предметне скло, додають краплю насиченого 3 % водного розчину конго червоного. Змішавши дві краплі разом, частину суміші наносять на чисте предметне скло і опускають на нього покривне скельце, стежачи за тим, щоб не було повітря. Надлишок рідини відсмоктують фільрувальним папером, придавлюючи скельце до предметного. Внаслідок утворення капілярного шару фарби і розміщення мікро­організмів в один шар при мікроскопії неімерсійним або імерсійними об’єктивами спостерігають живих бактерій і утворення прозорих ореол капсул навколо них.

За методом Бурріна середину предметного скла наносять краплю туші та змішують її з краплею культури капсульних мікроорганізмів. Роблять мазок шліфованим ребром предметного скла, висушують і мікроскопують. На темному фоні видно й ободок капсули навколо незабарвлених мікробів.Використовуючи метод Буррі-Гінса мазок роблять за методом Буррі, фіксують метиловим спиртом або полум’ям і після промиван­ня водою забарвлюють 5-10 хв карболовим розчином фуксину Ціля, розведеним 1:3 або тіоніном. Препарат промивають водою, висушу­ють і мікроскопують. На темному фоні спостерігають забарвлені в червоний або синій колір мікроорганізми, оточені світлим ободком -капсулою (рис. 15, вкл.).

5.Методика готування препаратів «висяча» і «роздавленна» крапля

 

Порядок роботи та техніка приготування препарату „роздавлена крапля”:

1. На центр знежиреного предметного скла нанести краплю рідкої бульйонної культури, якщо культура вирощена на щільному середовища, то на предметне скло нанести краплю стерильної дистильованої води та внести до неї, за допомогою бактеріологічної петлі, невелику кількість культури бактерій, що вирощена на щільному поживному середовищі, емульгувати.

2. На дослідний матеріал покласти покривне скло так, щоб не було пухирців повітря. Краплю слід роботи такої величини, щоб вона займала весь простір між покривним та предметним скельцями і не виступала за краї покривного. Якщо є надлишок рідини, то його слід видалити фільтрувальним папером, який слід відразу ж занурити у дезінфікуючий розчин.

3. Препарат можна розглядати як з „сухими” системами так і з імерсійною. Тож, мікроскопувати препарати слід використовуючи об‘єктиви 40х або 90х.

Порядок роботи та техніка приготування препарату „висяча крапля”:

1. Препарат готувати на покривному склі, в центр якого треба нанести одну краплю бактеріальної завісі.

2. Предметне скло з лункою, краї якої попередньо треба змастити вазеліном, притиснути до покривного скла, так щоб крапля знаходилася у центрі лунки, в результаті чого скельця склеюються.

3. Швидким рухом перевернути препарат покривним склом догори. Таким чином, отримується герметично закрита камера, в якій крапля довго не висихає. У правильно приготовленому препараті крапля вільно висить над лункою, не торкаючись її дна або краю.

4. Вивчити препарат під мікроскопом з боку покривного скла, при чому спочатку необхідно знайти край на малому збільшенні та при прикритій діафрагмі, використовуючи об‘єктив х8, потім на великому (об‘єктив х40) та продовжувати спостереження.

 

6.Алгоритм виділення чистої культури аеробів

Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів складається з ряду етапів. У перший день (І етап дослідження) у стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забирають патологічний матеріал. Його вивчають за зовнішнім виглядом,консистенцією, кольором, запахом та іншим ознаками, готують мазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. У деяких випадках (гостра гонорея, чума) на цьому етапі можна поставити попередній діагноз, а крім того, підібрати середовища,на які засіватиметься матеріал. Посів проводять бактеріологічною петлею (застосовується найчастіше), за допомогою шпателя за методом Дригальського, ватномарлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять у термостат при оптимальній температурі (37 °С) на 18-48 год. Мета етапу – одержати ізольовані колонії мікроорганізмів. Однак, деколи з метою нагромадження матеріалу його засівають на рідкі живильні середовища.

На другий день (ІІ етап дослідження) на поверхні щільного живильного середовища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Особливості росту бактерій на живильних середовищах є проявом їх культуральних властивостей. Чашки ретельно розглядають і вивчають ізольовані колонії, що виросли наповерхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер країв і поверхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. При потребі досліджують колонії під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. Структуру колоній досліджують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні чи волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній. З підозрілих колоній готують мазки, забарвлюють за методом Грама для вивчення морфологічних та тинкторіальних властивостей збудників, досліджують рухомість бактерій у “висячій” чи “надавленій” краплі. Ці ознаки мають надзвичайно велике діагностичне значення при характеристиці окремих видів мікроорганізмів. Рештки досліджуваних колоній обережно, не торкаючись інших, знімають із поверхні середовища і засівають на скошений агар або на сектори чашки Петрі із живильним середовищем для одержання чистої культури. Пробірки або чашки з посівами поміщають у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.

 

8.Середовище Хіса. Зробити висновок про ферментативну активність культури

Среды с углеводами и индикатором, используемые для определения сахаролитических св-в микробов впроцессе их идентификации. Сухие коммерческие среды содержат углевод (глюкозу, лактозу, сахарозу,маннит, мальтозу и др.), индикатор ВР (смесь водного голубого и розоловой к-ты), питательный агар и солиминеральные. Для приготовления Г. с. полужидких 20 г сухого порошка растворяют в 1 л дистил. воды приподогревании, доводят р-р до кипения, разливают в пробирки по 3 — 4 мл и автоклавируют 30 мин при 112°С .Правильно приготовленная среда должна иметь светло-розовый цвет и не прорастать в течение суточнойинкубации в термостате при 37°С. Иссл. к-ру засевают уколом петли в столбик среды, инкубируют втермостате при 37°С сутки или более в зависимости от идентифицируемого вида. Перекрашивание среды всиний или голубой цвет указывает на ферментацию сахара с образованием к-ты; такое же перекрашиваниесреды и появление в ее толще пузырьков — на ферментацию сахара с выделением к-ты и газа. Приотсутствии ферментативной активности у микроба среда мутнеет, но цвета не меняет. Г. с жидкие готовят на1% пептонной воде, рН 7,4, с 0,5-1% концентрацией углевода и индикатором Андраде или бромтимоловымсиним. В пробирки со средой опускают поплавки. Среду стерилизуют в автоклаве при 112°С в течение 30мин. Образование к-ты регистрируют по изменению цвета среды (соответственно в розовый и желтый),образование газа -по накоплению его в поплавках Начальный и при отсутствии ферментации цвет среды-соломенно-желтый с индикатором Андраде и желто-зеленый с индикатором бромтимоловым синим.

 

9.Середовище Ендо.Склад, характеристика колоній

Середовище Ендо складається з м’ясопептонного агару, 1% розчину лактози та індикатора у вигляді основного фуксину, знебарвленого сульфітом натрію (фуксиносірчиста кислота). Мікроорганізми, які мають фермент лактазу (лактозо-позитивні мікроорганізми), ферментують лактозу з утворенням альдегідів, фук-синосірчиста кислота переходить в альдегідсірчисту сполуку. Фуксин вивільняється, забарвлюючи колонії в червоний колір. Лактозонегативні бактерії утворюють безбарвні колонії на середовищі

10. Середовище Плоскирьова. Склад, характеристика колоній

Лактоагар Плоскирєва складається з м’ясопептонного агару, лактози, брильянтового зеленого, солей жовчних кислот, мінеральних солей та індикатора нейтрального червоного. Це середовище є не тільки диференціально-діагностичним, але й елективним, оскільки воно пригнічує ріст багатьох мікроорганізмів (мікроорганізмів повітря, кишкової палички та ін.), сприяє кращому росту збудників черевного тифу, паратифів та дизентерії.

11.Середовище Ресселя. Склад, характеристика змін при рості бактерій різних видів.

Среда Ресселя-ГРМ предназначена для первичной идентификации энтеробактерий по признаку ферментации лактозы и глюкозы.Представляет собой мелкодисперсный, гигроскопичный, светочувствительный  порошок светло-желтого цвета.

Состав:Панкреатический гидролизат рыбной муки, натрия хлорид, глюкоза, лактоза, бромтимоловый синий, агар.

Приготовление:Препарат в количестве, необходимом для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 6-8 мл в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием в течение 
20 мин при температуре 112 °С. Среду в пробирках скашивают, оставляя столбик высотой 15-20 мм.

Готовая среда имеет зеленый цвет.

Принцип действия:

Среда Ресселя-ГРМ содержит углеводы, которые, разлагаясь с образованием кислоты, вызывают изменение цвета индикатора бромтимолового синего из зеленого в желтый. При подщелачивании индикатор дает синее окрашивание.

Исследуемую культуру бактериологической петлей засевают в пробирку со средой уколом в столбик. Инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 18-20 ч.

Контроль качества:

Тест-штамм

Наблюдаемый эффект

Shigella flexneri I a 8516

Изменение цвета столбика среды в желтый и посинение ее скошенной части

Salmonella paratyphi A-225

Изменение цвета столбика среды в желтый с образование газа и  посинением скошенной части среды

Alcaligenes faecalis 415

Изменение цвета всей среды в синий или посинение ее скошенной части

Escherichia coli 055 К 59 № 339

Изменение цвета всей среды в желтый с образование газа в столбике

12.Середовище Кіта-Тороці. Склад, призначення, зміни рості бактерій.

Питательная среда Китта-Тароцци предназначена для культивирования облигатно-анаэробных бактерий, преимущественно клостридий, в том числе возбудителей анаэробной газовой инфекции (C.perfringens, C.novyi (oedematiens), C.septicum и др.).

ФОРМА ВЫПУСКА:Среда выпускается в герметично укупоренных флаконах по 200 мл.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СРЕДЫ:В стерильные пробирки опускают кусочки проваренной печени или проваренного мяса весом около 1 г. Разливают бульон Китта-Тароцци по пробиркам таким образом, чтобы столбик жидкости составлял не менее половины высоты пробирки. Поверх бульона наслаивают вазе­линовое масло, слой которого должен быть около 1 см. Пробирки за­крывают ватно-марлевой пробкой и автоклавируют при 0,5 атм. в тече­ние 30-35 мин.

ТЕХНИКА ИССЛЕДОВАНИЯ:Производят глубинный посев культуры или биологического материа­ла (под вазелин). Рост анаэробных бактерий сопровождается помутнением среды в большей степени в сторону дна пробирки. При росте клостридий, осо­бенно C.perfringens, как правило, наблюдают бурное газообразование. Фазы активного роста популяции C.perfringens завершаются в течение первых 8 часов, рост остальных видов патогенных клостридий в течение 8-16 часов.

 

 

 

 

 

 

13. Характеристика культуральних властивостей бактерій на МПА ы МПБ

Описати культуральні властивості колоній, що виросли на МПА.

При описанні культуральних властивостей колоній кишкової палички враховуйте такі ознаки:

форму колонії – округла, амебоподібна, неправильна та ін.;

розмір (діаметр) колонії вимірюють в мм;

поверхню колонії – гладка, шорстка, шкіряна, зморшкувата та ін.;

профіль колонії – плескаті, випуклі, кратероподібні та ін.;

блиск та прозорість – колонія блискуча, матова, прозора, борошноподібна;

колір колонії – колір колонії – безбарвна (сіро-білі відносять до безбарвних) або пігментована – біла, жовта, золотиста, помаранчева, червона, чорна;

краї колоніїрівні, зубчасті та ін.;

структуру колонії – однорідна, дрібно- або крупнозерниста та ін.;

консистенцію колонії визначають, коли торкаються до її поверхні петлею. Колонія може легко зніматися з агару, бути щільною, м’якою, що зростає в агар, слизоподібною (прилипає до петлі), плівчастою (знімається цілком), крихкою (легко ламається при дотику до неї петлею), в’язкою.

Чашка з ростом золотистого стафілокока та кишкової палички на МПА

Зверніть увагу на наявність різних колоній на чашці Петрі. Стафілокок утворює золотистий пігмент, колонії середнього розміру, рівномірно опуклі, з рівними краями. Кишкова паличка утворює безбарвні, мутні колонії з блискучою поверхнею та рівними краями.

 

 

Ріст різноманітних видів бактерій на рідких поживних середовищах:

1) холерний вібріон на поверхні лужної пептонної води утворює ніжну блакитну плівку;

2) стрептокок на цукровому бульйоні утворює придонний або пристінковий ріст, при цьому бульйон залишається прозорим;

3) бактерії тифопаратифозної групи (збудники черевного тифу, паратифів А та В) при рості на МПБ дають рівномірне помутніння;

 

4) спороутворюючі бактерії (B.subtilis) на м’ясопептонному бульйоні утворюють грубу плівку;

5) на водно-сироватковому середовищі під шаром стерильного вазелінового масла розмноження лептоспір не супроводжується зовнішньою зміною середовища.

 

 

 

 

 

 

 

 

14. Вибрати пробірки і чашки, що демонструють чинники патогенності стафілокока. Розповісти методику визначення.

 

Культивування. 
Факультативні анаероби. Добре ростуть на універсальних поживних середовищах при температурі 35-40 ° С (можливе зростання в інтервалі 6,5-46 ° С), оптимум рН 7,0-7,5. Додавання до живильного середовища глюкози або крові прискорює ріст стафілококів.Характерна властивість більшості штамів ‘- здатність рости в присутності 15% хлориду натрію або 40% жовчі. На МПА утворюють круглі, злегка піднімаються надповерхнею агару колонії з рівними краями діаметром 2-5 мм. Колонії можуть бути пофарбованими, так як стафілококи виробляють нерозчинні у воді пігменти, пов’язані з каротиноїдів. Найбільш інтенсивно пігменти утворюються на агарі з 10% знежиреного молока після 24-годинної інкубації при 37 ° С і на картоплі при температурі 20-25 ° С в аеробних умовах на світлі. S.aureus синтезує золотистий або оранжевий пігмент, зустрічаються і безпігментні штами; S.epidermidis, як правило, синтезує пігмент білого або жовтого кольору; у більшості штамів S.saprophyticus пігмент відсутній. 
При зростанні в МПБ стафілококи спочатку викликають дифузне помутніння з подальшим випаданням пухкого пластівчасті осаду.
 Характерно ростуть в стовпчику желатину. Через 24-26 год поряд з рясним зростанням за уколу намічається початкове розрідження середовища, яке потім збільшується, і до 4-5-го дня по ходу уколу утворюється воронка, наповнена рідиною. На кров’яному агарі патогенні штами стафілококів утворюють значну зону гемолізу. 
Біохімічні властивості. 
Стафілококи ферментують з утворенням кислоти без газу глюкозу, мальтозу, фруктозу, сахарозу, ксилозу, гліцерин, маніт і не розкладають дульцит, саліцин, інулін, раффинозу. Виділяють
 аміак і сірководень, не утворюють індол, відновлюють нітрати в нітрити; продукують каталазу, фосфатазу, уреазу; патогенні штами — аргінази. Згортають і пептонізіруют молоко, розріджують желатин, іноді згорнуту сироватку крові. 
Однак протеолітична активність у стафілококів може варіювати в значній мірі.
 
Токсиноутворення. 
Патогенні стафілококи синтезують і секретують високоактивні екзотоксини і
ферменти. Серед екзотоксинів виділяють чотири типи Гемотоксини (стафілолізінов), лейкоцідін і ентеротоксини. 

 

15. Розповісти методику і зробити висновок про токсигенність дифтерійної культури методом преципітації в гелі.

Для визначення токсигенності дифтерійних культур на чашку з агаром поміщається смужка фільтрувального паперу, змочена антитоксичною сироваткою, що містить у 1 мл 500 МО, потім роблять посів дифтерійних культур бляшками на відстані 1 см від краю смужки. Якщо культура продукує екзотоксин, він дифундує в живильне середовище і дає утворення преципітату з антитоксичною сироваткою у вигляді тонких ліній.

16. Зробити облік і висновок по реакції аглютинації. Досліджуваний матеріал – сироватка хворого з підозрою на черевний тиф (1:50). Тип реакції, інгрідієнти, механізм.

Для визначення титру протичеревно тифу антитіл у реакції розгорнутої аглютинації візьміть 6 пробірок. У першу пробірку внесіть 1 мл вихідного розведення сироватки (1:50). В усі 6 пробірок внесіть по 1 мл фізіологічного розчину. У першій пробірці одержимо розведення сироватки 1:100 при об’ємі 2 мл. З першої пробірки 1 мл перенесіть у другу пробірку, де розведення стане 1:200. Так зробіть ряд послідовних розведень сироватки в 5 пробірках (1:100, 1:200, 1:400, 1:800). З п’ятої пробірки 1 мл вилийте в дезрозчин. У всі 5 пробірок додайте по 2 краплі черевно тифового діагностикуму. Шоста пробірка є контролем діагностикуму (містить фізіологічний розчин і діагностикум). Такий контроль необхідний для виключення спонтанної аглютинації культури. Пробірки струшують і поміщають у термостат при температурі 37° на 2 години, а потім залишають на добу при кімнатній температурі, після чого роблять облік результатів реакції аглютинації.

 

17.Зробити облік РНГА. Принцип реакції, інгридієнти.

У цій реакції, антиген адсорбований на поверхні еритроцитів (еритроцитарний діагностикум), аглютинує зі специфічними антитілами (імунна сироватка). При позитивній реакції утворюється аглютинат у вигляді парасольки на дні лунок, у той час як у контролі без імунної сироватки, еритроцити осідають у центрі, утворюючи «ґудзик» із рівними краями. Реакція непрямої гемаглютинації є більш чутливою, ніж аглютинація бактерій, застосовується для діагностики при багатьох інфекційних захворюваннях, особливо у дітей, за необхідності виявлення антитіл у більш низьких титрах. Ця реакція може бути використана і для виявлення антигенів при застосуванні антитільних діагностикумів.

18. Визначити титр і робочу дозу комплементу.Дати характеристику комплементу.

 

 

 

 

 

19. Зробити облік РЗК. Дати висновок. Досліджуваний матеріал – сироватка хворого. Механізм, системи, інгредієнти.

Дослідна система

1. Сироватка особи, яка обстежується (пошук антитіл).

2. Антиген.

Комплемент — препарат сироватки крові морських свинок( 5-6 по 250-300 гр)

Індикаторна система (Гемолітична система)

4. Гемолітична сироватка.

5. Овечі еритроцити (3% суспензія)/ еритроцити барана

Реакцію проводять у 3 пробірках. Від титровані інгредієнти (антиген, комплемент, гемолітична сироватка) розводять фізіологічним розчином таким чином, щоб робоча доза їх містилася в 0,5 мл. Одночасно готують 3% суспензію овечих еритроцитів. У допоміжних пробірках розводять інактивовану прогріванням (56 °С – 30 хвилин) досліджувану сироватку. При постановці реакції спочатку змішують досліджувану сироватку, антиген і комплемент. Суміш витримують при температурі 37 °С упродовж 40 хвилин. Після зазначеного терміну в пробірку додають гемолітичну систему (2 мл гемолітичної сироватки + 2 мл 3% суспензії еритроцитів). Пробірки знову струшують та ставлять у термостат при 37 °С. Облік результатів реакції проводять після того, як відбудеться повний гемоліз у пробірках із контролем сироватки і контролем антигену.

Результати реакції визначають за наявністю чи відсутністю гемолізу у дослідній пробірці. Реакцію вважають позитивною при повній затримці гемолізу, коли рідина в пробірці безкольорова і еритроцити осідають на дно, а негативною – при повному лізисі еритроцитів, коли рідина інтенсивно забарвлена («лакова кров»). Ступінь затримки гемолізу оцінюють залежно від інтенсивності забарвлення рідини і розміру осаду еритроцитів на дні ( ++++, +++, ++, +). РЗК належить до непрямих двосистемних реакцій, яка використовується для серологічної діагностики (визначення в крові специфічних комплементзв’язуючих антитіл) за допомогою відомого антигену або визначення антигенів за допомогою відомих антитіл. Якщо в досліджуваній сироватці є специфічні до даного антигену антитіла, то утворюється комплекс антиген+антитіло, який приєднує до себе комплемент. Але цей процес є непомітним візуально. Для того щоб визначити, в якому стані знаходиться доданий комплемент (звязаний чи незвязаний), додається друга система, яка називається індикаторною. Гемолітична система готується перед постановкою реакції і складається з гемолітичної сироватки, яка містить антитіла проти овечих еритроцитів (гемолізини) та еритроцити барана (ЕБ). Імунна реакція гемолізу в цій системі відбувається за наявності незвязаного в першій системі комплементу. Як комплемент у РЗК використовується сироватка морської (гвінейської) свинки. Усі компоненти РЗК, за винятком досліджуваної сироватки, попередньо титруються і використовуються в робочій дозі.У тому випадку, коли в досліджуваній сироватці є специфічні антитіла, утворюється комплекс антиген+антитіло, який через Fc-фрагмент антитіл зв’язує комплемент, але це візуально не помітно. Тому додається до цієї суміші гемолітична система, і якщо комплемент звязаний у першій системі, то гемоліз у другій системі не відбувається, реакція позитивна – ЕБ знаходяться в осаді. У тому випадку, коли в досліджуваній сироватці антитіла відсутні, комплемент залишається в першій системі незв’язаним, вільним, і коли додається друга (гемолітична) система, відбувається гемоліз еритроцитів, що свідчить про те, що РЗК негативна. РЗК використовується для діагностики сифілісу, туберкульозу, бруцельозу, кандидозу, грипу та інших захворювань.

20. Вибрати препарати для створення активного імунітету проти інфекційного захворювання. Дати характеристику. Метод уведення, прищеплювальна доза. Термін вакцинації.

 

використанням живих (атенуйованих) вакцин:

1.

2. Туберкульоз.

3. Поліомієліт.

4. Кір.

5. Епідемічний паротит.

6. Краснуха.

7. Бруцельоз.

8. Грип.

9. Сибірка.

10. Чума.

11. Туляремія.

12. Жовта лихоманка.

13. Ку-лихоманка.

14. Натуральна віспа.

15. Висипний тиф.

 

використовують убиті (інактивовані) вакцини:

1.

2. Кашлюк.

3. Грип.

4. Сказ.

5. Холера.

6. Гепатит А.

7. Лепра.

8. Лептоспіроз.

9. Бруцельоз.

10. Гонорея.

11. Висипний тиф.

12. Аутовакцини.

 

використовують анатоксини:

1.

2. Дифтерія.

3. Правець.

4. Ботулізм.

5. Газова анаеробна інфекція.

6. Стафілококова інфекція.

7. Холера.

 

використовують хімічні вакцини:

1.

2. Черевний тиф.

3. Менінгококова інфекція.

4. Гемофільна інфекція.

5. Грип.

 

Вік

Щеплення проти

1 день

 

Гепатиту В

 

 

 

3 день

Туберкульозу

 

 

 

 

1 місяць

 

Гепатиту В

 

 

 

3 місяці

 

 

Дифтерії,

кашлюку,

правцю

Поліомієліту

Гемофільної

інфекції

4 місяці

 

 

Дифтерії,

кашлюку,

правцю

Поліомієліту

Гемофільної

інфекції

5 місяців

 

 

Дифтерії,

кашлюку,

правцю

Поліомієліту

 

6 місяців

 

Гепатиту В

 

 

 

12 місяців

 

 

 

 

Кору, краснухи,

паротиту

18 місяців

 

 

Дифтерії,

кашлюку,

правцю

Поліомієліту

Гемофільної

інфекції

6 років

 

 

Дифтерії,

правцю

Поліомієліту

Кору, краснухи,

паротиту

7 років

Туберкульозу

 

 

 

 

14 років

 

 

Дифтерії,

правцю

Поліомієліту

 

18 років

 

 

Дифтерії,

правцю

 

 

23 роки

 

 

Дифтерії

 

 

28 років

 

 

Дифтерії,

правцю

 

 

 

АКДП

Абсорбована коклюшно-дифтерійно-правцева вакцина. Вбита вакцина проти кашлюку. Дифтерійний та правцевий анатоксини абсорбовані на гідраті окису алюмію для створення „депо” препарату в місці введення вакцини для поступового антигенного подразнення клітин імунної системи, що сприяє посиленню імунної відповіді

2. Інактивовані вакцини. Для профілактики вірусних захворювань широко використовують інактивовані вакцини, які мають деякі переваги перед живими. Важливою умовою ефективності вакцин є вибір інактиватора та оптимальних умов інактивації, які дозволяють повністю усунути інфекційність вірусу при максимальному збереженні антигенності.
Методи інактивації вірусів. Для отримання надійних та безпечних вакцин використовують фізичні та хімічні інактиватори. Необхідно відмітити, що інактивація вірусу повинна бути не тільки ефективною, але й максимально ніжною (селективною). Тобто, зміни в структурі віріонів повинні бути мінімальними. Однак механізм інактивуючої дії в багатьох відношеннях недостатньо вияснений і їх використання часто емпіричне.
Фізичні методи. Найбільш розповсюдженими фізичними методами інактивації вірусів є гама — та ультрафіолетові промені.
Гама — промені — вид іонізуючого випромінювання з великою проникаючою здатністю. Відомо, що в основі дії їх лежать два ефекти: пряма та непряма дія. Перша заключається в безпосередньому поглинанні енергії випромінювання біологічними молекулами. Найбільш страждають від цього пуринові і пірамідінові основи. Непряма дія — вплив на об’єкт активних вільних радикалів НН, НО2 і молекулярних продуктів перекису водню, який утворюється внаслідок радіолізу води.
Численними дослідами встановлено, що при дії гама — променів інфекційність вірусів втрачається швидше, чим антигенність.
В наш час накопичені переконливі свідчення про можливість практичного використання гама — променів при отриманні антигенів та інактивованих вакцин проти сказу, грипу, віспи, гепатиту В та багатьох інших. Використання гама — променів має величезну перевагу перед традиційними методами, оскільки дає можливість одночасно та надійно інактивувати і стерилізувати готовий препарат. Ефективність УФ — променів визначається їх проникливістю і адсорбцією біологічними молекулами. Білки поглинають УФ — промені в меншій мірі, чим нуклеїнові кислоти і тому більш стійкі до їх дії. Під дією УФ опромінення змінюється структура нуклеїнових кислот вірусів, УФ — промені не впливають суттєво на білкову оболонку, внаслідок чого інактивовані віруси здатні зберігати свою антигенну та імуногенну активність.
В деяких випадках для інактивації вірусів використовують термоінактивацію. Основною причиною яка викликає інактивацію вірусу при нагріванні, є порушення структурної цілісності його генома.
До простих і доступних методів інактивації вірусів відносять фотодинамічну дію деяких фарб, таких як метиленова синька, акридіновий — оранжевий, нейтральний червоний, та інші, до яких чутливі більшість вірусів. Механізм цього явища повністю не вивчений. Вважають, що фотодинамічна інактивація вірусів пов’язана головним чином з пошкодженням нуклеїнової кислоти.
Хімічні методи. Із хімічних з’єднань, які найбільш часто використовують для інактивації вірусів, це формальдегід і бета-пропіолактон. Формальдегід інактивує віруси завдяки високій реакційній здатності по відношенню до білків і нуклеїнових кислот. Він вступає в з’єднання не тільки з вірусами, а й численними компонентами середовища в яке його добавляють. Взаємодіючи з нуклеїновими кислотами і білками, формальдегід реагує в основному з аміногрупами. Приєднуючись до аміногруп пуринів і пірамідинів він знищує матричну та інформаційну активність нуклеїнових кислот. 
При виготовленні інактивованих вакцин, крім формальдегіду, знайшов застосування також і глютаровий альдегід. Він викликає агрегацію віріонів завдяки утворенню міжмолекулярних зв’язків. Інактивація глутаральдегідом не супроводжується суттєвим зниженням антигенних властивостей вірусів, завдяки полімеризації білкових молекул. 
Бета — пропіолактон це високоактивний алкіліруючий агент, який не стійкий в водних розчинах і легко гідролізується з утворенням нешкідливих речовин: гідроакрилової та бета — оксипропіонової кислот. В зв’язку з чим відпадає необхідність в нейтралізації надлишку бета — пропіолактону і продуктів його розпаду.
Із інших хімічних речовин для інактивації вірусів використовують: 
— гідроксиламін; — азирідін; — етиленімін; — ацетілетиленімін (АЕІ); — димер етиленімін(ДЕІ).

Хімічна інактивація віріонів технічно більш проста. Однак з надійним пригніченням інфекційності можливі в ряді випадків суттєві зниження інших видів біологічної активності, в тому числі імуногенності.
Перед випуском інактивованої вакцини ретельно перевіряють її на відсутність вірусу, особливо якщо їх готують із вірулентних штамів. При фасуванні в ампули та флакони до неї додають фенол, мертіолят, формалін та інші консерванти для запобігання випадкового бактеріального забруднення.
Методи контролю інактивованих вакцин на авірулентність. Інактивовані вакцини в деяких випадках використовують для підсилення імунітету, який синтезований живими вакцинами. Основні показники якості інактивованих препаратів це безпечність та висока імуногенність.
При оцінці якості інактивованих вакцин першочерговим є контроль авірулентності, направлений на виявлення життєздатних віріонів. Вважається, що чим небезпечніший збудник, тим надійніші повинні бути умови інактивації та методи контролю її ефективності. Для визначення повноти інактивації вірусів в інактивованих вакцинах використовують чутливі біологічні об’єкти (культуру клітин, курячі ембріони, чутливі лабораторні тварини), а також використовують морфологічні та серологічні методи досліджень. В практиці виробництва інактивованих вакцин методи контролю на авірулентність особливо ретельно розроблені проти сказу, ящуру, поліомієліту та інших найбільш небезпечних інфекцій людини та тварин.

3. Живі вакцини. Живі вірусні вакцини — це, як правило, штучно ослаблені за допомогою культивування або природні авірулентні чи слабовірулентні імуногенні штами вірусу, котрі в серійних пасажах на природно чутливих тваринах не проявляють підвищення вірулентності і втратили здатність до горизонтальної передачі.
Вакцинні вірусні штами повинні відповідати вимогам по відношенню їх біологічної стабільності, насамперед, їх приживлємості, тобто здатність їх до розмноження в вакцинованому організмі повинна бути обмеженою. Вакцинні штами мають значно меншу інвазійність, чим їх вірулентні попередники. Це пов‘язано з їх частково обмеженим реплікативним потенціалом в місці проникнення або в органах — мішенях природного господаря. Реплікація вакцинних штамів в організмі легше пригнічується природними неспецифічними захисними механізмами. Штами розмножуються в вакцинованому організмі до тих пір, поки його захисні механізми не загальмують їх розвиток. Протягом цього часу утворюється така кількість антигену, яка здебільшого перевищує дозу його, яку вводять при інокуляції інактивованої вакцини.
При виготовленні живих вакцин використовують вакцинні штами тільки в тому діапазоні пасажів, який визначений для кожного із них в попередніх дослідах і є гарантом безпечності і активності вакцини. Основною перевагою живих вакцин вважається активізація всіх ланок імунної системи, яка забезпечує збалансовану імунну відповідь (системну і локальну; імуноглобулінову та клітинну). Це має особливе значення при тих інфекціях, коли клітинний імунітет грає важливу роль, а також при інфекціях слизових оболонок, де необхідний як локальний так і системний імунітет.
Високоімуногенні живі вірус — вакцини мають ту перевагу, що утворюють ранній неспецифічний захист який розвивається вже через 1 — 2 дні після введення вірусу завдяки гомологічній інтерференції. В ідеалі вакцинація повинна повторювати імунологічні стимули природної інфекції, зводячи до мінімуму небажані ефекти. Вона повинна викликати високий рівень імунітету при невеликій дозі вакцини. Необхідно, щоб її введення по можливості супроводжувалось слабкою, короткочасною загальною і місцевою реакцією та тривалим імунітетом. Живі вакцини більш, ніж інші, відповідають цим вимогам і крім того, відзначаються низькою вартістю і простотою використання. 
Більшість сучасних вакцин, які використовуються для профілактики інфекційних захворювань людини і тварин, отримані пасажами вірулентного вірусу в гетерологічному господарю (тварини, курячі ембріони, різноманітні культури клітин). Аттенуйовані в чужорідному організмі віруси піддаються мутаціям в геномі, що запобігає їх реверсії, тобто вони не здатні знову набувати вірулентних властивостей. 
Однією із головних вимог до вірус — вакцин, є відсутність реверсибільності вакцинних штамів. Вірус — вакцини, які використовуються в ветеринарії перевіряють по цьому критерію на природно чутливих тваринах. Аттенуйовані штами, що не підвищують реактогенності і не набувають вірулентності протягом 6 — ти послідовних пасажів на найбільш чутливих до природної інфекції видів тварин, вважаються придатними для виготовлення живої вакцини. 
Деякі живі вакцини не відповідають вимогам горизонтальної передачі, однак із — за їх високої ефективності приходиться миритись з циркуляцією вакцинного вірусу в популяції. Ряд авторів вважають позитивним явищем здатність аттенуйованих штамів виділятися в значних кількостях із організму вакцинованих тварин і імунізувати контактуючих з ними тварин даної популяції, полегшуючи тим самим формування групового імунітету.
Діаметрально протилежним явищем недостатньої аттенуації можна розглядати зверхаттенуацію вірусу, при якій можуть втрачатися корисні властивості аттенуйованих штамів і практичний сенс їх отримання.
Аттенуація вірусу за допомогою тривалого пасажування в клітинних культурах в наш час є основним методом отримання живих вірус — вакцин. Цей метод базується на селекції пасажних мутантів, які відрізняються біологічними властивостями від початкових вірулентних штамів. Отримані таким чином аттенуйовані імуногенні штами акумулюють в собі велике число спонтанних мутацій, що затрудняє вияснення природи їх аттенуації. Генетична основа аттенуації живих вірус — вакцин в більшості випадків залишається невідомою. Необхідно відмітити, що незважаючи на великі практичні досягнення, аттенуація вірусів шляхом пасажування в системі гетерологічного господаря — в цілому це процес не керований, а результати його часто непередбачувані.

4. Гетерологічні вакцини. Принцип дії гетерологічних живих вакцин оснований на антигенному споріднені вакцинного штаму і збудника інфекційного захворювання, проти якого бажають створити імунітет. Антигенна спорідненість збудників пояснюється тим, що їх імуногенні білки мають аналогічну або дуже близьку структуру. Мова йде про дженерівський підхід — використовування вірусів тварин для імунізації людей проти антигенно — родинних вірусів людини. В наш час цей метод отримав широке застосування в ветеринарній практиці. Відомий цілий ряд вірусів, які можна використовувати як гетерологічні вакцини у тварин. Приклади, так вірус віспи голубів використовують для вакцинації проти віспи курей. Вірус фіброми Шоупа запобігає захворюванню кролів на міксоматоз. Парвовірусний ентерит собак профілактують вірусом панлейкемії котів, а інфекційний гепатит собак аденовірусом типу — 2 собак. Вказані віруси входять в склад комерційних моно — і полівалентних вакцинних препаратів.
Тісне антигенне споріднення знайдено в представників роду морбіллівірусів родини параміксовірусів. Наприклад, гомологія матриксного гена (кодує М білок) вірусів чуми ВРХ і корі складає 77,6 %, а вірусів чуми ВРХ і чуми собак — 78, 2%. З часу відкриття тісного родинного зв’язку між збудниками чуми собак, корі людей і чуми ВРХ мільйони доз протикоревої вакцини були з успіхом використані для імунізації цуценят проти чуми м’ясоїдних. При цьому тривалість імунітету продовжувалась протягом 5 — 6 місяців. Однак вірус чуми собак не викликає імунітету до вірусу корі.
Встановлено тісний антигенний зв’язок у деяких представників інших родин. Так, у коронавірусів собак і свиней (вірус ЗГС) знайдена, по крайній мірі, одна загальна антигенна детермінанта в протективному білку, яка забезпечує практично однаковий захист новонароджених поросят при імунізації матерів гомо — і гетерологічним вірусом. Приблизно такі ж взаємовідношення встановлені в інших представників пестівірусів. Багатьом дослідникам вдалося захистити свиней проти КЧС введенням ВД ВРХ. Для представників герпесвірусів характерна наявність перехресних антигенних зв’язків, які свідчать про перспективність їх використання в гетерологічній імунізації:
— вірус герпесу кіз — інфекційний ринотрахеїт ВРХ;
— герпес тип-2 ВРХ — проти герпес тип-1 людини.
Найбільш відомим і економічно важливим прикладом використання гетерологічних вакцин в сучасній ветеринарній практиці є використання вакцини із вірусу герпесу індиків проти хвороби Марека курей. Його з великим успіхом використовують у всьому світі як вакцину проти цієї інфекції, яка завдає величезних матеріальних збитків промисловому птахівництву. Вакцинація добових курчат цією вакциною дає можливість різко знизити відхід птиці, зумовлений хворобою Марека.
Однією із переваг використання гетерологічних вірусів для вакцин є те, що можна надійно проводити диференційну діагностику між вакцинним штамом і збудником інфекції, проти якої проводили вакцинацію. Недоліком використання таких вакцин є небезпека зараження природно чутливих до цих збудників видів тварин, а також те, що імунний захист, який забезпечується такими вакцинами, як правило, слабкіший того, який досягають аттенуйованими штамами гомологічного вірусу.

5. Субодиничні вакцини. Одним із можливих шляхів удосконалення противірусних препаратів є конструювання субодиничних (компонентних) вакцин.
Субвірусні компоненти отримують руйнуванням віріонів з тим , щоб в вакцину включати тільки ті компоненти, які викликають утворення нейтралізуючих антитіл. Субодиничні вакцини, як правило, готують із поверхневих структур (капсидів, суперкапсидів і клітинних мембран), які мають протективні антигени. Для створення подібних препаратів, перш за все, необхідно виявити антиген або антигени віріону, які виконують протективну функцію.
Структурні протективні антигени ідентифіковані у багатьох вірусів. Це білки або частіше глікопротеїни, які розміщуються в поверхневих структурах віріонів. При введенні тваринам вони викликають синтез віруснейтралізуючих антитіл і забезпечують специфічний захист. Необхідно пам’ятати й те, що при деяких вірусних інфекціях, таких як герпес-, ретровіруси та інші протективні антигени можуть бути зв’язані з поверхнею інфікованих клітин і бути вірусоспецифічними невіріонними компонентами.
Відомо, що більшість тяжких вірусних інфекцій людини і тварин викликають складні віруси, які мають зовнішню ліпопротеїнову оболонку вкриту пепломерами в склад яких входять глікопротеїни. Саме в групі вірусів із зовнішньою ліпопротеїновою оболонкою був досягнутий найбільший успіх в виділенні субодиниць.
Було встановлено, що суміш діетилового ефіру і твіну здатна руйнувати ліпідну мембрану вірусу грипу.

Завдяки цьому була проведена велика серія досліджень з багатьма вірусами. Розробку субодиничних вакцин розпочали в зв’язку з необхідністю підвищення ефективності інактивованої вакцини проти грипу людини. Такі вакцини, які мають поверхневі антигени вірусу — гемаглютинін і нейрамінідазу, менш токсичні, чим інактивовані цільновіріонні вакцини, однак підвищення захисного ефекту не досягнуто.
Приготування субвірусних вакцин включає в себе ряд етапів:
— отримання очищеного вірусу;
— виділення протективних компонентів із віріонів та їх очистка;
— приготування самого вакцинного препарату.
Технологія отримання очищених глікопротеїнів зв’язана з вирішенням двох основних проблем — дезінтеграцією вірусних частинок і очисткою глікопротеїнів від субвірусних компонентів, а також солюбілізуючого агенту (розчинника).
Для дезінтеграції вірусних частинок можна використовувати досить широкий спектр препаратів. Це протеолітичні ферменти, ліпази, органічні розчинники, луги, детергенти. Органічні розчинники солюбілізують мембранні ліпіди і звільняють глікопротеїни вірусної оболонки. Їх використовують в основному для отримання розщеплених, так званих спліт — вакцин із вірусів грипу, сказу та інших. Розщепленні вакцини отримують шляхом дезінтеграції вірусів з метою вилучення або інактивації вірусного генома. В цілому органічні розчинники не вважаються кращим засобом для приготування субодиничних вірусних препаратів.
При отриманні субодиниць вірусів знайшли також використання протеолітичні ферменти. Є данні про використання бромеліну для виділення гемаглютиніну без залишків нейрамінідази із вірусу грипу, а також глікопротеїнів вірусу корі. Трипсин використовували для вилучення поверхневих виступів з поверхні вірусу везикулярного стоматиту. Обробка протеазами супроводжується розщепленням поліпептидної частини глікопротеїну, що призводить до втрати ділянки молекули, зануреної в ліпідний шар і до зниження імуногенної активності глікопротеїну.
Найбільш вдалі розчинники вірусних глікопротеїнів — детергенти. По фізико — хімічним властивостям їх розділяють на три основні групи: іонні детергенти, солі жовчних кислот і неіонні детергенти.
Із неіонних детергентів для отримання вірусних глікопротеїнів частіше всього використовують тритон Х — 100 та нонідент Р — 40. Ці агенти по своїй дії порівняно ніжні і не пошкоджують субодиниць. Тому останні зберігають свою антигенність і їх можна використовувати для приготування вакцин. З їх допомогою отримані глікопротеїни вірусів грипу, парагрипу, сказу, багатьох герпесвірусів та інших.
В результаті обробки вірусної суспензії розчинним агентом отримують суміш вірусних нуклеотидів і поверхневих субодиниць. Використовуючи гельфільтраційну хроматографію та ультрацентрифугування в градієнті щільності сахарози можна легко отримати очищені субодиничні препарати в промислових умовах. Самий простіший метод відокремлення субодиниць від небажаних залишків вірусів — це адсорбція на гідраті окису алюмінію при відповідному значенні рН.
Створення субодиничних вакцин, — найбільш важливий аспект практичного застосування глікопротеїнів. Вакцини, створені таким шляхом, майже повністю складаються із специфічного і імунізуючого білка і тому, є специфічними антигенами.
Імуногенну активність компонентних вакцин часто підсилюють включенням в їх склад ад’юванта. Опубліковані експериментальні дані, відносно ефективності цих вакцин часто протирічиві. В основному вони стосувались порівняльної оцінки імуногенності цільновіріонних і субодиничних вакцин. Одні дослідники вважають, що ці вакцини недостатньо активні, інші — переконують нас в їх високій активності.
6. Реасортантні вакцини. Віруси, які мають сегментований геном, такі як вірус грипу і ротавіруси, можуть бути аттенуйовані шляхом генної реасортації. Аттенуація цих вірусів заключається в тому, щоб вже аттенуйованим штамам придати необхідну антигенність. Від донорів аттенуації беруть гени, які кодують білки і обмежують реплікацію, від епізоотичних (епідемічних) штамів беруть гени, які кодують поверхневі протективні білки (глікопротеїни). Вірусні реасортанти були отримані при рекомбінації вірулентних штамів вірусу грипу А людини різноманітними генетично модифікованими штамами цього вірусу. Існує декілька способів для досягнення аттенуації вірусу грипу шляхом реасортації генів. 
Перший заключається в аттенуації вірусу донора генів послідовним пасажуванням вірусу в курячих ембріонах. Аттенуйовані для людини штами можуть бути використані для рекомбінації з епідемічними штамами. 
Другий спосіб принципово схожий з першим і відрізняється від нього тим, що аттенуацію здійснюють пасажуванням вірусу при зниженій температурі (25-30оС). Властивості аттенуації передається від холодно адаптованого донорського штаму польовим ізолятом вірусу при рекомбінації. Отримані таким чином реасортанти при випробовуваннях на волонтерах показали себе стабільними і зберегли ознаки аттенуації та імуногенності. 
Третій спосіб заключається в тому, що для реасортації генів донором аттенуації використовують штами вірусу грипу птахів, невірулентних для людини. 
Четвертий спосіб базується на отриманні температурочутливих (ts) мутагенів вірусу за допомогою хімічних агентів.
Найбільш поширеним є другий метод аттенуації. Вважається, що для забезпечення достатнього рівня аттенуації та її стабільності необхідно, щоб реасортантні штами отримали від донора шість генів.
7. Рекомбінантні живі вакцини. Сьогодні найбільший ефект для отримання цих вакцин отриманий з вірусом вісповакцини, як рекомбінантного вектора. Цей вірус має великий геном з різними ділянками, в які можуть бути вмонтовані чужорідні гени без суттєвого порушення здатності вірусу вісповакцини до реплікації. Чужорідні білки, які експресує рекомбінантний вірус вісповакцини, зберігають свої антигенні властивості. Використання вірусу вісповакцини, як вектора для вакцинації має цілий ряд переваг. Це здатність розповсюджувались в клітинах багатьох видів тварин для експресії декількох генів здатних індукувати гуморальний і клітинний імунітет.
8. Рекомбінантні субодиничні вакцини. Ці вакцини готують із очищених вірусних білків, які продукуються клонованими вірусними генами. ДНК — вірусу або його ДНК — копію ( для вірусу з РНК — геномом) можна легко ввести в відповідну плазміду і клонувати в відповідній бактеріальній клітині, наприклад в E. coli. В подальшому клоновані вірусні ДНК, кодуючі протективний антиген, можуть бути введені в бактерії, дріжджі і постійні клітинні лінії і експресовані в них з метою отримання антигену в достатній кількості для виготовлення рекомбінантної субодиничної вакцини. При виборі клітинної системи для експресії рекомбінантних вірусних антигенів важливу роль грають такі критерії як ефективність, безпечність і технологічність прокаріотичній системі були отримані капсидний білок VP 1 вірусу ящуру, поверхневий антиген вірусу гепатиту В, гемаглютинін вірусу грипу А, поверхневий глікопротеїн G вірусу сказу та інші. Білок VP1 вірусу ящуру ефективно експресується в E. coli, складаючи приблизно 17% від загальної кількості білка, виробленого в трансформованій бактерії. При з’єднанні з неповним ад’ювантом Фрейнда рекомбінантний білок індукує резистентність у ВРХ, свиней і морських свинокакопичені експериментальні данні, що засвідчують переваги використання еукаріотичних систем експресії, особливо дріжджів. Виробництво вірусних антигенів в дріжджах це приклад ефективного використання гетерологічної системи для розробки противірусної вакцини. Дріжджі не тільки здатні до росту з високою щільністю в суспензійних культурах і ферментерах, але й забезпечують різносторонність модифікації утворених рекомбінантних білків, які не можливо здійснити в рекомбінантних бактеріях. В результаті є можливість отримувати матеріал з високою специфічною імунологічною активністю. 
9. Синтетичні вакцини. Синтетичні вакцини — це препарати, які мають штучно синтезовані короткі пептиди, що імітують невеликі ділянки протективних антигенів вірусу, здатні викликати специфічну імунну відповідь організму і захищати його від конкретного захворювання. Сучасні технологічні розробки в виробництві вакцин на основі реплікації антигенів зорієнтовані на отримання мінімальних структур, які мають протективні антигенні детермінантиспіхи в молекулярній біології і пептидному синтезі забезпечили основу для виробництва необмеженої кількості очищених вірусних білків або синтетичних пептидів для використання в імунопрофілактиці.Ідентифікація основних антигенних сайтів протективних білків більшості актуальних вірусів дала можливість синтезувати антигенно активні поліпептиди проти вірусів гепатиту В, грипу, ящуру, полімієліту та інших. Дослідження показали їх здатність викликати утворення специфічних антитіл у тварин. Однак синтетичні пептиди виявилися слабкими антигенами і для підсилення імуногенності вони повинні бути з’єднані з білком — носієм або синтетичним біополімером або до них додають ад’ювант.

21. Вибрати діагностичні препарати. Дати характеристику. Назвати методи їх застосування.

Діагностичні препарати

При проведенні діагностики інфекційних захворювань широко використовуються імунологічні методи дослідження, які дозволяють за допомогою серологічних реакцій підтвердити клінічний діагноз, а також вид збудника.

Використання цих методів можливо тільки за наявності високоякісних препаратів, до яких належать антигени, діагностикуми, алергени, діагностичні сироватки та імуноглобуліни.

Проведення серологічних реакцій ґрунтується на специфічності зазначених препаратів. Тобто за допомогою відомого антигену в сироватці крові виявляють відповідні, специфічні до нього антитіла і, навпаки, за допомогою відомих антитіл (діагностичні сироватки) виявляють відповідні (специфічні) антигени.

Діагностикуми і антигени

Доведено, що всі антигени відносно до антитіл мають специфічність, тобто антиген взаємодіє тільки з тими антитілами (імунною сироваткою), які синтезувалися в організмі під впливом цього антигену.

З цієї закономірності випливає практичний висновок: за допомогою відомого антигену можна виявити відповідні (специфічні) до нього антитіла в досліджуваній сироватці крові. Цей метод одержав назву – серологічна діагностика інфекційних захворювань. Антигенами є корпускули (клітини) мікроорганізмів, стандартизована завись яких називається діагностикум.

Антигенами є також специфічні білки, полісахариди, одержані з клітин мікроорганізмів. Залежно від походження розрізняють бактеріальні, рикетсіозні та вірусні діагностикуми.

У практиці широко використовують еритроцитарні діагностикуми, які готують шляхом адсорбції мікроорганізмів або окремих антигенів на поверхні овечих еритроцитів.

Усі антигени та діагностикуми, включаючи еритроцитарні, використовують для серологічної діагностики інфекційних захворювань. Антигени використовують при проведенні реакції зв’язування комплементу (РЗК), реакції преципітації (РП), імуноферментного аналізу та ін. реакцій.

Діагностикуми використовують при проведенні реакції аглютинації (на склі і розгорнутої), еритроцитарні діагностикуми – при проведенні реакції непрямої (пасивної) гемаглютинації.

Приклади діагностикумів і антигенів, які використовують у серологічній лабораторії:

бруцельозний діагностикум (завись бруцел, убитих формаліном або нагріванням);

дизентерійні діагностикуми (Зонне і Флекснера) містять завись дизентерійних бактерій, убитих формаліном;

сальмонельозні діагностикуми (завись сальмонел, убитих формаліном);

черевнотифозні О-, Н-, ОН-діагностикуми;

еритроцитарний черевнотифозний Vi-діагностикум;

туляремійний діагностикум (завись туляремійних бактерій, убитих формаліном);

рикетсіозні діагностикуми (завись рикетсій, вирощених у жовточному мішку курячого ембріона);

еритроцитарний сальмонельозний О-діагностикум;

еритроцитарний кашлюковий діагностикум;

гонококовий антиген;

розчинний кашлюковий антиген;

полісахаридний антиген із грибів Candida albicans.

Приклад опису гонококового антигену – антигенвмісний препарат, який використовують з діагностичною метою в реакції зв’язування комплементу для визначення титру специфічних антитіл.

Діагностичні сироватки

Другий компонент імунологічних реакцій антитіла також мають сецифічність, тобто здатність вступати в реакцію та утворювати комплекс тільки з тими антигенами, під впливом яких вони синтезувалися в організмі.

Це дозволяє використовувати імунні сироватки, які містять відомі за специфічністю антитіла, для визначення антигенів (мікроорганізмів) у серологічних реакціях.

Імунні сироватки, які використовують для визначення виду інфекційного захворювання, називаються діагностичними.

Методи серологічної ідентифікації мікроорганізмів грунтуються на властивості антитіл, які містяться в діагностичних сироватках, вибірково з’єднуватися з комплементарними антигенами мікроороганізмів.

Діагностичні сироватки одержують шляхом імунізації лабораторних тварин (кроликів) мікробними зависями, суспензіями вірусів, анатоксинами, окремими очищеними антигенами збудників. Імунізацію проводять за спеціальною схемою. Потім тварин обезкровлюють, сироватку відокремлюють від кров’яного згустка та визначають титр антитіл у серологічній реакції. Титр антитіл – це найбільше розведення сироватки, де ще відмічається позитивна реакція.

Діагностичні сироватки використовують для:

1. Експрес-діагностики (індикації) збудника в матеріалі від хворих і в різних об’єктах зовнішнього середовища.

2. Ідентифікації збудника в чистій культурі – на завершальному етапі бактеріологічного дослідження.

Для експрес-діагностики використовують мічені (флуоресціюючі) сироватки, антитіла в яких з’єднані (кон’юговані) з флюорохромом, який дає світіння під впливом ультрафіолетового проміння. Досліджувальний матеріал фіксують на предметному склі, потім наносять мічену сироватку зі специфічними антитілами і через 30 – 40 хвилин обережно змивають водою, сушать і мікроскопіюють за допомогою люмінісцентного мікроскопа. Якщо утворився комплекс антитіл з антигеном (мікробом), то в полі зору видно мікроорганізми, які світяться, наприклад палички збудника.

Приклади флуоресціюючих (мічених) сироваток:

флуоресціюючі протихолерні антитіла являють собою мічені флюорохромом гамма-глобулінові фракції аглютинуючої О-сироватки;

флуоресціюючі протичумні антитіла;

суха флуоресціююча сироватка проти сибірки та ін.

Використовується також метод непрямої люмінесцентної мікроскопії, при якій на препарат на склі спочатку наносять звичайну (нефлуоресціюючу) діагностичну сироватку. Потім змивають нанесену сироватку та наносять мічену антиглобулінову видову сироватку (до гамма-глобулінів тварин, яка була використана для одержання діагностичної сироватки). Таким чином одержують комплекс, який складається із антигену, на якому сорбовані специфічні антитіла, які, у свою чергу, оточені флуоресціюючими антитілами, що світяться.

Для непрямої імунолюмінесцентної мікроскопії випускаються флуоресціюючі антивидові сироватки проти глобулінів-коней, кролика і деяких тварин. Флуоресціюючі сироватки випускаються в ампулах у вигляді ліофільно висушеного препарату.

З діагностичною метою у більшості випадків для виявлення специфічних антигенів використовують преципітуючі сироватки. Реакція преципітації може бути поставлена в преципітаційних пробірках або в гелі. Прикладом класичного методу є реакція Асколі для виявлення сибіркового антигену (іноді чумного, туляремійного, менінгококового), а також визначення видової належності кров’яної плями в судово-медичній практиці.

Преципітація в гелі використовується для кількісного визначення імуноглобулінів різних класів (IgM, IgG, IgA) у крові та інших біологічних рідинах здорових або хворих людей із метою оцінки стану гуморального імунітету.

Для ідентифікації збудників у чистій культурі на завершальному етапі бактеріологічного дослідження використовують здебільшого аглютинуючі сироватки. Приклади таких сироваток:

аглютинуючі адсорбовані сальмонельозні О- і Н-сироватки;

аглютинуючі ОК-сироватки проти ентеропатогенних типів кишкових паличок;

аглютинуючі холерні О, ОН, Огава, Інаба-сироватки.

Приклад опису аглютинуючої адсорбованої сальмонельозної О-сироватки – антитільний препарат, який використовується з діагностичною метою в реакції аглютинації на склі для вивчення антигенної структури сальмонел. Сироватка отримана шляхом гіперімунізації кролів О-антигеном.

 

22. Вибрати імуноглобуліни. Пояснити метод одержання, призначення, види, пререваги перед суцільними сироватками

Лікувально-профілактичні імунні сироватки та імуноглобуліни

Для специфічної терапії і профілактики ряду інфекційних захворювань використовують препарати, які містять антитіла. З цією метою використовують сироватки штучно імунізованих тварин (часто коней) або в деяких випадках людей-донорів. У наш час широко використовують імуноглобуліни, які одержують як гамма-глобулінову фракцію імунної сироватки. Імуноглобуліни порівняно з імунними сироватками містять більшу концентрацію антитіл і в них відсутні баластні білки. Тому при введенні їх в організм не буває ускладнень. При використанні імунних сироваток і імуноглобулінів пасивний імунітет створюється в короткий термін і захищає від захворювання навіть у випадку зараження, яке вже відбулося. При внутрішньовенному введенні імуноглобулінів захисний імунітет виникає відразу після ін’єкції. Після внутрішньом’язового і підшкірного введення імунних сироваток та імуноглобулінів антитіла в крові в захисній концентрації з’являються через 12 – 24 години.

Одним із недоліків дії імунних сироваток та імуноглобулінів є короткий термін створеного ними пасивного імунітету. Гетерогенні сироватки створюють імунітет на 1–2 тижні, гомологічні на 4–5 тижнів. При введенні сироваток виникають ускладення алергічної природи: анафілактичний шок та сироваткова хвороба.

З лікувальною та профілактичною метою використовують головним чином антитоксичні сироватки та імуноглобуліни.

Антитоксичні сироватки використовують для специфічної профілактики тих інфекційних захворювань, збудники яких продукують екзотоксини. В медичній практиці найчастіше використовують такі антитоксичні сироватки: протидифтерійну, протиправцеву, протиботулінічну, протигангренозну. Механізм лікувальної дії цих сироваток полягає в тому, що вони нейтралізують екзотоксини відповідних збудників. Титрують ці сироватки в реакції флокуляції, активність вимірюється в антитоксичних або міжнародних одиницях (АО, МО). Наприклад, за 1 АО протидифтерійної сироватки беруть мінімальну її кількість, яка зв’язується з однією імуногенною одиницею відповідного анатоксину і викликає початкову (ініціальну) флокуляцію, або на чутливих тваринах нейтралізує 100 Dosis letalis minima дифтерійного токсину. Для специфічної терапії та профілактики дифтерії, правцю, ботулізму та газової гангрени існують також відповідні імуноглобуліни.

Крім того, для специфічної терапії та профілактики інших інфекційних захворювань використовують імуноглобуліни: протистафілококовий, протисибірковий, протилептоспірозний, протигрипозний, проти кліщового енцефаліту, проти натуральної віспи, проти сказу, проти поліомієліту та інші.Приклад опису протидифтерійної антитоксичної сироватки: Антитільний препарат, що використовується з лікувально-профілактичною метою. Цей препарат стимулює утворення пасивного гуморального антитоксичного специфічного імунітету. Антитоксична сироватка отримана шляхом гіперімунізації коней анатоксином та екзотоксином.

 

23. Вибрати препарати для імунофлюоресцентного методу. Розповісти принцип методу і його варіанти.

Пряма реакція імунофлуоресценції (РІФ)

Пряма РІФ ґрунтується на тому, що мікроби або антигени тканин, до яких додані імунні сироватки зі специфічними антитілами, міченими флуорохромами, починають світитися зеленим світлом в УФ-променях люмінесцентного мікроскопа. Бактерії в препараті на склі, обробленому такою сироваткою, світяться по периферії клітини у вигляді облямівки зеленого кольору

 

24.Врахувати та зробити висновок по реакції Райта. Досліджуваний матеріал сироватка хворого ( у розчиненні 1:50).

Реакція Райта (А. О. Wright) — серологічний метод лабораторної діагностики бруцеллезной інфекції.

Реакція Райта високо специфічна і стає позитивною з самого початку хвороби. Найбільш високі титри реакції Райта (80% і вище) зазвичай спостерігаються через 1-2 міс. після початку захворювання і зберігаються протягом гарячкового періоду. Надалі титри реакції починають падати, і до кінця першого року захворювання реакція Райта, як правило, стає негативною. Поява і накопичення аглютинінів у крові хворих на бруцельоз залежать від ступеня антигенного подразнення. Тому найбільш високі показники титрів аглютинінів спостерігаються у фазі бактеріємії, різко знижуючись у міру загасання інфекційного процесу.

Іноді реакція Райта зберігається позитивною до 2-3 і навіть 5 років після перенесеного захворювання. Однак у цих випадках слід мати на увазі можливість повторного інфікування і рецидивів захворювання. У деяких випадках класичного бруцельозу (див.), підтвердженого виділенням гемокультури і позитивної алергічною пробою, реакція Райта може бути від’ємною; це можливо при зараженні організму зміненим в антигенному відношенні штамом бруцел. Завдяки деякої спільності в антигенній структурі слабоположительные результати реакції Райта можуть бути у людей, інфікованих збудниками туляремії, холери, і при деяких інших інфекційних захворюваннях, а також у осіб, вакцинованих проти цих інфекцій. Слабоположітельная реакція Райта (в розведеннях 1:50, 1:100) іноді спостерігається і у здорових жінок в останні тижні вагітності. Повторна постановка реакції Райта (спостереження за її динамікою) дозволяє диференціювати специфічну реакцію Райта від неспецифічної, так як підвищення титрів вказує на наявність бруцеллезной інфекції.

Істотну роль у реакції Райта грає підбір штамів для приготування діагностикумів (диссоційовані штами для цієї мети не придатні), а також концентрація застосовуваної мікробної суспензії. Крім антигену, джерелом помилок може бути і досліджувана сироватка. Вона повинна бути свіжою, негемолизированной, прозорою (без еритроцитів тощо) і без ознак проростання сторонньою мікрофлорою.

При постановці реакції Райта іноді спостерігаються так звані проагглютинационные зони, тобто негативний результат з малими розведеннями сироватки і чітко виражений позитивний результат при більш високих розведеннях; можливо також випадання аглютинації в середній частині ряду розведень. Явище це частіше спостерігається при високих титрах сироваток і робить необхідним застосування довгого ряду розведень. Поява феномена зони, мабуть, пов’язано з наявністю в сироватках крові неповних (блокують) антитіл. Сироватку крові для дослідження отримують звичайним способом.

Реакцію Райта ставлять завжди з двома контролями: а) контроль кожної з досліджуваних сироваток для виключення помилкової аглютинації за рахунок випадання білків самої сироватки і б) контроль антигену — одна пробірка при будь-якій кількості досліджуваних сироваток — для виключення спонтанної аглютинації антигену. Физиол. розчин, який застосовується для розведення сироватки і антигену, повинен виготовлятися на дистильованій воді нейтральної реакції (рН=6,9-7,1) і щоб уникнути проростання містити 0,5% карболової кислоти. Реакцію Райта ставлять не менш ніж у п’яти розведеннях(1:50, 1:100, 1:200, 1:400 і 1:800) в об’ємі 1 мл кожна. В якості антигену застосовують діагностикум, подтитрованный з національної стандартної противобруцеллезной агглютинирующей сироватці. Перед вживанням діагностикум розводять в 10 разів карболизированным (0,5%) фізіологічним розчином. В 1 мл розведеного діагностикумів міститься близько 6-109 мікробних клітин.

Облік реакції проводять через 24 години шляхом порівняння ступеня просвітлення в дослідних пробірках з відповідним стандартом каламутності, який готують наступним чином. В 4 пробірки послідовно наливають 1, 2, 3 і 4 мл розведеного діагностикумів, потім в тому ж порядку додають 3, 2 і 1 мл карболизированного фізіологічного розчину, в останню пробірку нічого не додають. Після збовтування вміст беруть по 0,5 мл антигену кожної концентрації і 0,5 мл карболизированного фізіологічного розчину. Таким чином отримують 4 пробірки стандарту мутності з різним ступенем просвітлення (75% — 3-, 50% — 2 — і 25% — 1 — й відсутність просвітлення), які разом з досвідченими пробірками поміщають у термостат при t° 37° на 24 години, після чого проводять облік реакції. Для єдиної системи обліку в даний час рекомендують вираз титрів сироваток у міжнародних одиницях антитіл (ME). Діагностичним титром досліджуваної сироватки вважається 50% аглютинації (2+).

Перерахування титру сироватки на міжнародні одиниці роблять наступним чином. Стандартизований діагностикум зі стандартною противобруцеллезной агглютинирующей сироваткою, що містить 1000 ME антитіл в 1 мл, дає 50% аглютинації в розведенні цієї сироватки 1 : 500. Отже, титри досліджуваної сироватки 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200 і т. д. з застосуванням стандартизованого діагностикумів вказують на те, що в 1 мл досліджуваної сироватки міститься 100, 200, 400 і т. д. міжнародних одиниць антитіл. Таким чином, перерахування титру досліджуваної сироватки на міжнародні одиниці виробляють шляхом її подвоєння. При діагностичній оцінці результатів реакції аглютинації рекомендується наступна схема: титр сироватки 1 : 50 (100 МО) — результат сумнівний, 1 : 100 (200 ME)- слабо позитивний, 1 : 200 (400 ME) — позитивний, 1 : 200 і вище (800 ME)- різко позитивний.

 

25. Вибрати необхідні інгрідієнти для реакції Хедельсона. Розповісти методику. Переваги і хи реакції.

Прискорена реакція Хеддлсона в модифікації радянських вчених досить проста, чутлива і прийнятна для масових обстежень. Для постановки реакції Хеддлсона беруть з пальця близько 1 мл крові, відстояна сироватка повинна бути абсолютно прозорою. Готують пластинку віконного скла, ретельно знежирену спиртом і разграфленную на 6 квадратів. Сироватку крові хворого наливають за допомогою градуйованої піпетки в центр кожного квадрата в наступних кількостях: 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 мл До кожної з цих сироваток додають по одній краплі антигену Хеддлсона (вбита культура бруцел, підфарбована метиленовим синім). Потім сироватку, починаючи з мінімальних доз, змішують з антигеном скляною паличкою. Контроль агглютинирующих, властивостей сироватки ставлять у п’ятому квадраті (0,03 мл сироватки і 0,03 мл ізотонічного розчину хлориду натрію), а контроль антигену в шостому квадраті (0,03 мл антигену і 0,03 мл ізотонічного розчину хлориду натрію). Далі скло рівномірно підігрівають протягом 2 хв. над полум’ям спиртівки. Якщо реакція позитивна, то вже через 6-8 хв. у краплях сироватки, до яких був доданий діагностикум, з’являються пластівці, пофарбовані в синій колір.

 

26. Зробити урахування реакції Асколі. Принцип, інгрідієнти, висновок, досліджуваний матеріал – хутряний виріб.

Асколі реакція — реакція преципітації (термопреципитации) для виявлення збудника сибірської виразки або його антигену у різних субстратах (шкіра, шерсть, повсть, щетина, сукно, м’ясо, земля, випорожнення тварин тощо). З досліджуваного матеріалу готують шляхом кип’ятіння протягом 5-45 хв. витяжку в ізотонічному розчині хлориду натрію або екстрагують антиген 0,5% карболової або оцтовою кислотою в ізотонічному розчині хлориду натрію. Екстракт фільтрують через паперовий фільтр або азбестову вату або центрифугують при 1000-3000 об/хв. У вузьку пробірку для преципітації наливають імунну преципитирующую противосибиреязвенную сироватку і обережно нашаровують на неї випробуваний екстракт. Протягом найближчих 10 хв. на кордоні між сироваткою і екстрактом в позитивних випадках з’являється кільце помутніння (кольцепреципитация). Асколі реакція дуже чутлива і специфічна. З її допомогою можна швидко виявити матеріали, інфіковані сибірською виразкою. См. також Преципітація, Серологічні дослідження, Сибірська виразка.

Реакція асколі (A. Ascoli) — діагностична реакція преципітації, яка використовується для діагностики сибірки. Полягає у виявленні в досліджуваному матеріалі термостабільного сибіреязвенного антигену за допомогою преципитирующей сибіреязвенной сироватки. Шматочки органів, шкури, шкіру, шерсть полеглих тварин, іноді м’ясо, ковбасу і молочні продукти, витяжки з землі заражених пасовищ і скотомогильників, фураж подрібнюють, заливають потрійним об’ємом 0,5% розчину 80% оцтової кислоти у фізіологічному розчині NaCl і екстрагують протягом 10-15 хв. в апараті Коха або автоклаві при t° 110°. Екстракт нейтралізують, фільтрують до повної прозорості через щільний паперовий фільтр або прокалену азбестову вату. Присутність сибіреязвенного антигену виявляють нашаруванням екстракту відтягнутою пастерівської піпеткою на преципитирующую сироватку у вузьких пробірках в об’ємі 0,5 мл Зручно користуватися спеціальними пробірками Асколі (рис.). При позитивній реакції на кордоні між сироваткою і екстрактом негайно або через 5 — 10 хв. з’являється кільцеподібне помутніння, стає все більш інтенсивним. Отримані результати перевіряються контрольними пробами (див. табл.).

 

№ пробірки (проби)   Вміст пробірки

1   Преципитирующая сироватка + екстракт з досліджуваного матеріалу

2   Преципитирующая сироватка +

   +екстракт селезінки завідомо сибіреязвенного тварини

3   Преципитирующая сироватка +

   + екстракт з агарової культури бацил сибірської виразки

4   Преципитирующая сироватка +

   +екстракт з матеріалу, взятого від здорової тварини

5   Преципитирующая сироватка + фізіологічний розчин NaCl

6   Нормальна сироватка + екстракт з досліджуваного матеріалу

7   Нормальна сироватка +

   +екстракт селезінки завідомо сибіреязвенного тварини

8   Нормальна сироватка + фізіологічний розчин NaCl

У пробірках № 4, 5, б і 7 кільця помутніння відсутні. А. р. можна ставити за скороченою схемою: проби 1, 2, 5 і 6.

Прилад для реакції Асколі: 1 — воронка; 2 — фільтр; 3 — капілярна трубка; 4 — екстракт; 5 — кільце преципітації; 6 — сироватка.

 

27. Врахувати та зробити висновок по реакції Васермана.